コロナウィルスは生物兵器だった 完結編(5)

有名な医学雑誌Antiviral Research誌に掲載された研究論文により、CoVid-19コロナウイルスが、効果的に『ヒト集団感染させる機能獲得特性』を持っていることが明らかになった。以下論文の概要の訳文を全文掲載する

抗ウイルス研究

176巻、2020年4月、104742

新しいコロナウイルス2019-nCoVのスパイク糖タンパク質には、同じクレードのCoVにはないフリンのような切断部位が含まれています。

ヒトコロナウイルス(CoV)は、ニドウイルス目に属するエンベロープを持つプラス鎖RNAウイルスで、主に上気道および消化管感染症の原因です。その中でも、それぞれ2002年と2013年に蔓延したSARS-CoVとMERS-CoVは、重症の肺炎や細気管支炎などの重篤な人間の病気、さらにはより耐性が弱い集団の髄膜炎と関連している。 2019年12月、武漢市で新しいCoV(2019-nCoV)が検出され、この新たなウイルス感染は致死率が2〜3%の重度のヒト呼吸器疾患と関連していた。最初は動物の宿主から人間に、おそらく増幅宿主を介して伝染したと推定される。しかし、人から人への感染が報告されており、2020年2月初旬にWHOによって報告された、640人以上の死亡を含む> 31,000人の感染が確認された持続的な流行の拡大につながっています。推定有効生殖数(R)値〜2.90(訳注:一人の感染者から2.9人の感染者が出るという事。これが1以下なら感染は収束していく。この場合3に近いので、ネズミ算的に感染は拡大していく。)集団発生の初期にパンデミックが発生する可能性があります。これにより、WHOは国際保健機関の公衆衛生緊急事態として宣言するようになりました。これまでのところ、利用可能な特定の抗ウイルス治療やワクチンがないため、R値はそのまま感染拡大に関連づけられます。そのゲノムシーケンスに基づいて、2019-nCoVはベータコロナウイルスの系統bに属し(下の図1A参照)、これにはSARS-CoVとバットCoV ZXC21も含まれ、後者とCoV ZC45は2019-nCoVに最も近いものです。 2019-nCoVは、SARS-CoVとSpike(S)-タンパク質配列で約76%、CoV ZXC21と80%のアミノ酸配列同一性を共有しています。この論文では、Sタンパク質の部位の1つ(下の図1B参照)の近くに存在する特定のフューリン様プロテアーゼ認識パターンに焦点を当てます。

図1. SARSのようなCoVと比較した、Sタンパク質配列のS1 / S2切断部位におけるnCoV特異的配列の特徴(A)アルファコロナウイルス(α-Cov)属およびベータコロナウイルス(β-CoV)属から選択されたコロナウイルスの系統樹、系統a、b、cおよびd:2019-nCoV(NC_045512.2)、CoV-ZXC21(MG772934)、SARS -CoV(NC_004718.3)、SARSのようなBM4821(MG772934)、HCoV-OC43(AY391777)、HKU9-1(EF065513)、HCoV-NL63(KF530114.1)、HCoV229E(KF514433.1)、MERS-CoV( NC019843.3)、HKU1(NC_006577.2)。系統樹は、Mega Xソフトウェアによる最尤法を使用して、Orf1abアミノ酸配列で取得されました。アスタリスクは、サイト1に標準的な切断部位の存在を示します。 (B)S1 / S2部位でのCoV-ZXC21および2019-nCoVからのSタンパク質のコーディングおよびアミノ酸配列のアライメント。 2019-nCoV固有のシーケンスは太字で示しています。この位置のCoV-ZXC21 Sタンパク質のシーケンスは、2019-nCoVのシーケンスを除く、系統bに属する他のベータコロナウイルスのシーケンスを表しています。 

プロタンパク転換酵素(PC;遺伝子PCSK)は、健康状態と疾患状態の両方でさまざまな生物学的プロセスを調節する9つのセリン分泌プロテアーゼのファミリーを構成します。 PCは、タンパク質分解により、増殖因子、ホルモン、受容体、接着分子などのさまざまな前駆体タンパク質や、感染性ウイルスの細胞表面糖タンパク質の活性化に関与します。 7つのPCは、モチーフ(R / K)-(2X)n-(R / K)↓内の特定の単一またはペアの塩基性アミノ酸(aa)で前駆体タンパク質を切断します。多くの重要な細胞表面タンパク質の処理におけるそれらの役割のため、PC、特にフューリンはウイルス感染に関与しています。それらは特異的にウイルスエンベロープ糖タンパク質を切断する可能性があり、それにより宿主細胞膜とのウイルス融合を増強すします。HCoV-OC43(Le Coupanec et al。、2015)、MERS-CoV(Millet and Whittaker、2014)、HKU1(Chan et al。、2008)などの人間に感染するコロナウイルスの場合、スパイクタンパク質が示されていますS1 / S2切断部位(図2)で切断され、S1およびS2サブユニットが生成されます。上記の3つのウイルスは、標準(R / K)-(2X)n-(R / K)↓モチーフを表示します(表1)。さらに、ウイルスエンベロープ糖タンパク質切断部位の周りの変動が細胞向性と病因に役割を果たすことが実証されています。たとえば、以前一部のCoVに以前はSタンパク質配列内のフューリン様切断部位を挿入すると新しい症状が発現する事が知られている。たとえば、感染性気管支炎ウイルス(IBV)Sタンパク質に同様の切断部位を挿入すると、感染したニワトリの病原性が高くなり、顕著な神経症状や神経向性が生じます

表1.コロナウイルス(上)と他のRNAウイルス(下)のエンベロープタンパク質切断部位の比較配列。 空欄:一致するモチーフは検出されませんでした。

(訳注:モチーフとは配列モチーフの事で具体的には特徴的な塩基あるいはアミノ酸配列の事。)

図2.推定上の成熟部位に焦点を当てた、ヒト2019-nCoV Sタンパク質の概略図。ドメインは、以前はSARS-CoVおよびMERS-CoVで特徴付けられていました:シグナルペプチド(SP)、N末端ドメイン(NTD)、受容体結合ドメイン(RBD)、融合ペプチド(FP)、内部融合ペプチド(IFP)、7つ1/2(HR1 / 2)、および膜貫通ドメイン(TM)を繰り返します。 SP、S1↓S2およびS2 ‘切断部位は矢印で示されている。異なるCoV S1 / S2およびS2 ‘切断部位のシーケンスは、Multalinウェブサーバー(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)を使用して手動で調整し、図をESPript 3(http:// espript)を使用して準備しました。 .ibcp.fr / ESPript / ESPript /)は、アライメントの下部にあるSARS-CoV Sタンパク質の二次構造を示しています(PDB 5X58)。切断部位の挿入は黒い枠で囲まれています。赤いアスタリスクは、S1 / S2サイトに標準的な風鈴のような切断モチーフの存在を示します。 (この図の凡例における色の参照の解釈については、この記事のWebバージョンを参照してください。)

同様に、インフルエンザウイルスの場合、低病原性形態のインフルエンザウイルスは、トリプシン様プロテアーゼによって切断される切断部位に単一の塩基性残基を含み、活性化プロテアーゼの組織分布は通常、呼吸器および/または腸器官に感染する。逆に、インフルエンザの高病原性型には、フリンを含むさまざまな細胞プロテアーゼによって切断されるフリンのような切断部位があり、ウイルスの細胞親和性の拡大を可能にするさまざまな種類の細胞で発現されます。さらに、H5N1ヘマグルチニンHA切断部位への多塩基モチーフRERRRKKR↓GLの挿入は、香港での1997年の集団発生時のウイルスの高病原性と関連している可能性が高い。このモチーフは、P1で重要なArg、P2とP4で塩基性残基、P6とP8、およびP2 ‘位置で脂肪族Leuを示します(表1)(Schechter and Bergerの命名法(Schechter and Berger、1968))。風鈴のような開裂特異性(Braun and Sauter、2019; Izaguirre、2019; Seidah and Prat、2012)。

コロナウイルスSタンパク質は、CoVウイルス粒子の王冠のような形の原因となる構造タンパク質であり、元の名前「コロナウイルス」はその造語から生まれました。 〜1200 aaの長いSタンパク質はクラスIウイルス融合タンパク質に属し、細胞受容体結合、組織向性、および病因に寄与します(Lu et al。、2015; Millet and Whittaker、2014)。これには、いくつかドメインとモチーフが含まれています(図2)。三量体Sタンパク質は、感染時に宿主細胞のプロテアーゼによってS1 / S2切断部位で処理されます。切断後、プライミングとしても知られるこのタンパク質は、同種の細胞表面受容体を認識するN末端のS1外部ドメインと、ウイルスの侵入に関与するC末端のS2膜アンカー型タンパク質に分かれています。 SARS-CoV S1-タンパク質には、アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)を認識する保存された受容体結合ドメイン(RBD)が含まれています(Li et al。、2003)。 SARS-CoVはコウモリとヒトの両方の細胞に結合し、ウイルスは両方の生物に感染する可能性があります(Ge et al。、2013; Kuhn et al。、2004)。 S1 / ACE2のRBD表面は、SARS-CoVのS1に14 aaが関与していることを示しています(Li et al。、2005)。その中で、8つの残基は2019-nCoVで厳密に保存されており、ACE2は新しく出現したnCoVの受容体でもあるという仮説を支持しています(Wan et al。、2020)。 S2タンパク質には、融合ペプチド(FP)、2番目のタンパク質分解部位(S2 ‘)、内部融合ペプチド(IFP)、膜貫通ドメイン(TM)の前にある2つの7反復ドメイン(図2)が続きます。特に、2019-nCoVとSARS-CoVのIFPは同一であり、ウイルス融合ペプチドの特性を示しています(図2)。細胞侵入に関与する分子メカニズムはまだ完全には理解されていませんが、FPとIFPの両方がウイルス侵入プロセスに参加している可能性があり(Lu et al。、2015)、したがって、Sタンパク質は両方のS1 /ウイルス侵入のためのS2およびS2 ‘切断部位。 IFPの下流にあるP1およびP2の基本的な残基とP2 ‘の疎水性Phe(SeidahおよびPrat、2012)を含むKR↓SFの風鈴のようなS2’切断部位は、2019-nCoVとSARS-CoVで同じです(図2)。 MERS-CoVおよびHCoV-OC43では、S1 / S2サイトがRXXR↓SAに置き換えられ、P1およびP4の基本的な残基、およびP2 ‘にAla(脂肪族ではない)が含まれています。しかし、他のより病原性の低い循環ヒトCoVでは、S2 ‘切断部位は一塩基性R↓S配列のみを示し(図2)、基本的な残基はありません。

P2および/またはP4のいずれかでフューリン切断を可能にする必要があり、標的細胞によって発現される同族プロテアーゼに応じて、開始ステップでの効率の低い切断またはより高い制限が示唆されます。2019-nCoVのS2 ‘での処理はSタンパク質の最終的な活性化の重要なイベントであると予想されていますが、このプロセスに関与するプロテアーゼはまだ決定的に特定されていません。 2019-nCoV S2 ‘シーケンスと上記の引数に基づいて、1つ以上のフューリン様酵素がKR↓SFのS2’サイトを切断することを提案します。 S2 ‘とは対照的に、RBDとFPの間の最初の切断(S1 / S2切断部位、図2)は、多くのCoVについて広く研究されています。興味深いことに、S1 / S2プロセシングサイトはコロナウイルス間で異なるモチーフを示し(図2、サイト1およびサイト2)、それらの多くは塩基性残基の後に切断を示します。したがって、プライミングプロセスは、S1 / S2切断部位の配列に応じて、異なる宿主細胞プロテアーゼによって保証される可能性があります。したがって、RSVR↓SVモチーフを含むMERS-CoV Sタンパク質は、ウイルスの放出中に、おそらくフューリンによって切断されます。逆に、SARS-CoVのSタンパク質は、生合成後、おそらく好ましいフリン様切断部位(SLLR-ST)の欠如が原因で、ほとんど切断されないままです。この場合、受容体結合後、Sタンパク質は保存配列AYT↓M(SLLR-STの10 aa下流にある)で、エラスターゼ、カテプシンL、TMPRSS2(Bosch et al)などの標的細胞のプロテアーゼによって切断されると報告されています。プライミングイベントはウイルスの侵入に不可欠であるため、標的細胞のプロテアーゼによるこの活性化ステップの有効性と程度は、細胞親和性とウイルスの病因を調節するはずです。 2019-nCoV Sタンパク質の場合、保存されたサイト2の配列AYT↓Mは、おそらくサイト1での好ましいフューリン切断の後で、まだ切断されている可能性があります(図2)。

フリンは肺で高発現しているため、気道に感染するエンベロープウイルスがこの転換酵素をうまく利用して、その表面糖タンパク質を活性化する可能性がある。 2019-nCoVが登場する前は、この重要な機能はベータコロナウイルスの系統bでは見られませんでした。しかし、それは実験的にフリンによって処理されることが示された、それらのSタンパク質にフリン様切断部位を有する他のCoV(HCoV-OC43、MERS-CoV、MHV-A59)(図2;表1)によって共有されています。驚くべきことに、2019-nCoV Sタンパク質配列には、単一のArg↓切断部位1(図1、図2)の上流に12個の追加ヌクレオチドが含まれており、予測される溶媒に曝されたPRRAR↓SV配列につながり、これは標準的なフューリンに切断部位が対応します。このフリンのような切断部位は、ウイルスの放出中に切断され、Sタンパク質の「プライミング」のために機能し、2019-nCoVに機能獲得をもたらし、他の血統bベータコロナウイルスと比較して、人間の集団で効率的に拡散する可能性があります。これは、無関係なCoV間の収束進化経路を示している可能性があります。興味深いことに、このサイトが処理されない場合、SARS-CoVで観察されるように、ウイルスのエンドサイトーシス中にSタンパク質がサイト2で切断されることが予想されます。

明らかに、私たちの主張を実験的に実証するにはさらに多くの作業が必要ですが、そのような処理酵素の阻害は潜在的な抗ウイルス戦略を表す可能性があります。実際、最近、ウイルス感染を制限するために、多くのウイルスに感染した宿主細胞が、インターフェロン応答を誘発して、フリン様酵素の酵素活性を阻害することが示されました。また、HIV感染はプロテアーゼ活性化受容体1(PAR1)またはグアニル酸結合タンパク質2および5(GBP2,5)のいずれかの発現を誘導し、トランスゴルジネットワーク(PAR1)または初期ゴルジコンパートメント(GBP2、5)へのフューリンの関与。全体として、これらの観察結果は、フリン様酵素の阻害剤がウイルス増殖の阻害に寄与している可能性があることを示唆しています。

フリン活性を阻害して腫瘍の増殖、ウイルスおよび細菌感染を制限するために、さまざまなアプローチが提案されてきた。したがって、α-1アンチトリプシンポートランド(α1-P​​DX)と呼ばれる、コンセンサスフリン切断を持つ天然のセリンプロテアーゼ阻害剤α-1アンチトリプシンの変種は、フリンを阻害し、HIV-1 Envの処理を妨げます。多塩基性切断モチーフのC末端にクロロメチルケトン(CMK)部分を追加し、N末端にデカノイルグループを追加して、細胞透過(dec-RVKR-cmk)を促進すると、フリン、PC7、PC5の酵素活性が不可逆的にブロックされます、PACE4およびPC7。フリンの結晶構造は、2,5-ジデオキシストレプタミン由来の阻害剤の設計をもたらし、阻害剤の2つの分子がフューリンと複合体を形成します。 フリン様酵素は多くの細胞プロセスに関与しているため、1つの重要な問題は、何らかの毒性をもたらす可能性のある全身阻害を回避することです。 したがって、そのような小分子阻害剤、またはおそらく吸入により送達され、持続的な阻害を可能にするためにフリンからの遅い解離速度を示す他のより強力な経口活性のものは、2019に対する抗ウイルス効果を評価するために迅速にテストするに値する可能性があります 。

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